便攜式三聚氰胺檢測儀

便攜式三聚氰胺檢測儀

檢測方法
      便攜式三聚氰胺檢測儀，利用酶聯免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。

檢測原理(lǐ)
      ，酶聯免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通(tōng)過均質及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行(xíng)免疫測定。先将三聚氰胺酶标記物，樣品萃取物及标準加入到已經包被有(yǒu)三聚氰胺抗體(tǐ)的微孔中開(kāi)始反應。在30分鍾的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶标記物競争結合微孔中的三聚氰胺抗體(tǐ)，孵育30分鍾後洗掉小(xiǎo)孔中所有(yǒu)沒有(yǒu)結合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标記物。在用去離子水(shuǐ)清洗結束後，每孔中加入清澈的底物溶液，結合的酶标記物将無色的底物轉化為(wèi)藍(lán)色的物質。孵育30分鍾後停止此反應，根據各孔顔色深淺進行(xíng)數(shù)據讀取。依據标準的顔色得(de)出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

實驗所需設備及材料
三聚氰胺檢測試劑盒（目前常用進口試劑有(yǒu)美國Abraxis公司和(hé)美國Beacon公司的）
318C酶标儀一台或MB100（配有(yǒu)450nm濾光片）
1－5ml可(kě)調移液器(qì)
100－1000ul可(kě)調移液器(qì).
20－200ul可(kě)調移液器(qì).
蒸餾水(shuǐ)或去離子水(shuǐ)..
可(kě)吸取50ul的移液器(qì)及吸頭.
可(kě)吸取50ul和(hé)100ul的八道(dào)移液器(qì)及吸頭.
吸水(shuǐ)紙或相當的吸水(shuǐ)材料.
450nm的酶标儀.
計(jì)時(shí)器(qì).
洗瓶
混旋器(qì).
20mM PBS：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水(shuǐ)定容至1000ml.
注意事項
配套使用試劑，不要同其它公司的産品混用，不要将不同批次的産品混用。
樣品稀釋或含有(yǒu)雜質很(hěn)可(kě)能對結果的準确性有(yǒu)影(yǐng)響。
不要使用過期的産品。
使用之前将所有(yǒu)試劑回升至室溫，但(dàn)不要放置超過24小(xiǎo)時(shí)。
三聚氰胺屬于有(yǒu)毒性的化學品，請(qǐng)小(xiǎo)心處理(lǐ)。
停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚。
樣品制(zhì)備（以美國Beacon試劑為(wèi)例）
濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：100）
均質樣品至布丁狀。
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水(shuǐ)溶液，并劇(jù)烈振蕩。
超聲萃取1分鍾。
漩渦混合1分鍾，然後靜置5分鍾，使樣品分層。
3000 g室溫離心5分鍾。
用玻璃纖維濾紙過濾上(shàng)清液，并将萃取液收集于一幹淨試管中。
用樣品稀釋液将濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul進行(xíng)分析。
注意：用此方法測定了8個(gè)添加有(yǒu)15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回），回收率範圍為(wèi)75%-117%。
本方法隻可(kě)作(zuò)為(wèi)樣品篩選方法，不可(kě)作(zuò)為(wèi)終确認方法。
小(xiǎo)麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數(shù)：500）
1.均質或混勻小(xiǎo)麥面筋蛋白樣品。
2.稱取0.2g均質好的樣品加入10mL酸化的60%甲醇/水(shuǐ)溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水(shuǐ))。
3.漩渦混合并超聲萃取，使樣品溶解（确保樣品中沒有(yǒu)結塊）。
4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。
5.10000轉/分離心上(shàng)清液10分鍾。
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上(shàng)清液，并将萃取液收集于一幹淨試管中。
7.移取150 ul進行(xíng)分析。
注意：如果樣品中含有(yǒu)大(dà)量的添加物，需要加入更大(dà)量的萃取溶液，以保證萃取效率。
操作(zuò)人(rén)依據自己的判斷力，如果測試結果比較高(gāo)，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進行(xíng)二次測定。
幹的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：200）
1.質器(qì)均質幹的寵物飼料樣品。
2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水(shuǐ)溶液，并劇(jù)烈振蕩。
3.超聲萃取1分鍾。漩渦混合1分鍾，然後靜置5分鍾，使樣品分層。
4.3000 g室溫離心5分鍾。
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上(shàng)清液，并将萃取液收集于一幹淨試管中。
6.用樣品稀釋液将濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul進行(xíng)分析。

免疫測定過程(注意:标準及樣品做(zuò)平行(xíng)試驗以增加準确度)
将所有(yǒu)試劑及樣品回升至室溫20-280C，但(dàn)不要放置超過24小(xiǎo)時(shí)。
從鋁箔袋中拿(ná)出要求數(shù)量的微孔條，放入幹燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮
吸取150ul标準、樣品到對應微孔中，必須保證每種溶液使用幹淨的吸頭吸取，避免交叉污染。加入50ul三聚氰胺酶标記溶液到每個(gè)小(xiǎo)孔中。
混合60秒(miǎo)，20-28攝氏度下孵育30分鍾。
将微孔中的溶液倒入水(shuǐ)槽中，用蒸餾水(shuǐ)*充滿微孔，震蕩後倒掉，重複三次，總共四次洗闆。
在吸水(shuǐ)紙上(shàng)拍打，盡可(kě)能将水(shuǐ)拍幹。
每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液。
20-28攝氏度下，孵育30分鍾。
每個(gè)微孔中加入100ul停止液。
450nm下讀闆。
結果分析
MB100，半定量的結果是由樣品的吸光率與标準的吸光率的簡單對比而來(lái)判定:樣品的顔色比标準的顔色淺則三聚氰胺的濃度比标準樣的濃度高(gāo),樣品的顔色比标準的顔色深則三聚氰胺的濃度比标準樣的濃度低(dī)。
定量分析需要繪制(zhì)以标準樣的吸光率為(wèi)X軸,以标準樣的濃度的半對數(shù)為(wèi)Y軸的曲線圖.依據标準樣吸光率的點畫(huà)成一直線,如此樣品的光吸收率可(kě)在線上(shàng)找到,與此相對應的Y軸則為(wèi)樣品的濃度,樣品光吸收率範圍應比标準樣的底範圍高(gāo),比高(gāo)範圍低(dī),即可(kě)說明(míng)此樣品中三聚氰胺的含量大(dà)于500ppb或小(xiǎo)于20ppb。

操作(zuò)步驟：
 
試劑盒大(dà)同小(xiǎo)異；
１．将樣品用甲醇或水(shuǐ)提取，離心
２．将試劑盒梅标闆室溫下回溫至少(shǎo)一個(gè)小(xiǎo)時(shí)
３．提取液＼标準１５０微升，移入酶标闆井
４．加入ＨＲＰ５０微升
５．震動，反應３０分鍾
６．倒掉反應液，用清洗液沖洗４次，吸水(shuǐ)紙吸水(shuǐ)
７．加入色原底物１００微升，放置３０分鍾
８．加入終止液１００微升，
９．１５分鍾後４５０ｎｍ下比色
１０．根據标準曲線，計(jì)算(suàn)三聚氰胺的濃度
試劑盒，酶标儀４５０ｎｍ，１０００微升＼２００微升、５０微升移液槍和(hé)八道(dào)移液槍，吸水(shuǐ)紙，槍頭等。
注意移液時(shí)間(jiān)和(hé)避免交叉污染。每次要有(yǒu)标準曲線。